白千层精油的化学成分与抑菌活性研究

摘  要  为研究白千层精油的化学成分及其对植物病原真菌的抑菌活性，为环境友好型农药的研发及白千层的综合应用提供理论依据。本文采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术分析了白千层精油的化学成分，并用菌丝生长速率法测定了白千层精油对4种植物病原真菌的抑菌活性。从白千层精油中分离鉴定出74种化学成分，占总含量的97.28%，其主要化学成分是左旋-α-蒎烯（2.07%）、β-月桂烯（1.05%）、1，8-桉叶素（67.29%）、萜品烯（2.52%）、芳樟醇（2.36%）、α-松油醇（7.93%）和（+）-g-桉叶油醇（1.26%）等。进一步研究表明，白千层精油在5.0～10.0 µL/mL浓度范围对立枯丝核菌菌丝生长抑制率为100%;处理2 d时，白千层精油在2.5～10.0 µL/mL浓度下对小孢拟盘多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌的菌丝生长抑制率达71.59%以上，其抑菌作用均随着处理浓度的增加而增强，随着白千层精油处理时间的延长，对3种植物病原菌表现出较好的持效性。白千层精油对立枯丝核菌、小孢拟盘多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌均具有较强的抑菌活性，在农用抗菌剂应用中有较好的应用潜力。

关键词  白千层;精油;化学成分;植物病原真菌;抑菌活性

中图分类号  S793.931      文献标识码  A

白千层（Melaleuca leucadendron Linn.），属桃金娘科（Myrtaceae）白千层属（Melaleuca）植物，原产于澳大利亚新南威尔士北海岸[1]，目前我国广西、广东、福建、海南等地均有较大规模的引种栽培。文献资料显示，白千层属植物次生化合物具有多种生物活性。臧文霞等[2]发现白千层的石油醚萃取物对胃癌细胞、人肺腺癌细胞和肝癌细胞的体外增殖较好的抑制作用;李燕婧等[3]报道互叶白千层（Melaleuca alternifolia Linn.）醇提物具有抗炎、镇痛、抗菌、抗过敏等药理作用，且毒性小。现在广为使用的为白千层属植物精油（常称茶树油），其属天然油脂，具有消毒、杀菌抑菌、抗病毒、防霉、消炎止痛、化痰止咳等多种活性，可以高效、无毒、无刺激地杀死多种真菌和细菌，对某些病毒也有抑制作用，广泛应用于药品、日用卫生制品、皮肤保健品、化妆品、食品香料等诸多领域[4-14]。

在防治植物病害的过程中，长期大量的使用化学合成农药会带来环境污染、农残超标，生态平衡受损、生物多样性下降等一系列的生态环境问题，因此筛选开发与环境友好的植物源农药是必然趋势。不少的研究报道证实植物精油对农业植物病原真菌有抑菌抗菌作用[15-20]，植物精油可以作为新一代植物源农药开发研究的方向。目前白千层属植物精油对细菌的作用研究较多，互叶白千层精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、绿脓杆菌以及白色念珠菌等具有较强的抗菌活性[21-25]。本文旨在研究白千层精油的化学成分及其对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani KÜhn）、小孢拟盘多毛孢菌[Pestalotiopsis microspora （（Y2-4））]、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzac Cavgra）和香蕉枯萎病菌[Fusarium oxysporum f. sp. cubense（ （E. F. Smith）） Snyder et Hansen]等4种植物病原真菌的抑制作用，以期为白千层属植物精油的综合开发利用和绿色生物农药的开发研究提供依据。

1  材料与方法

1.1  材料

白千层原液精油：原料源自越南，由英国雪莉派思香薰有限公司（The UK sShirley pPrice aAromatherapy Ltd.）生产。

供试菌种：立枯丝核菌，由广东省微生物菌种保藏中心提供;小孢拟盘多毛孢菌，由中国热带农业科学院广州实验站郑丽博士提供;水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌，均由华南农业大学资源环境学院植物病理室李敏慧博士提供。供试病菌用PDA培养基（广东环凯微生物科技有限公司生产）培养备用。

仪器与设备：Agilent 7890B-5977A气质联用仪，美国安捷伦公司;LRH-250A生化培养箱，上海常思工贸有限公司;DGX-9143BC-1电热鼓风干燥箱，上海沪粤明科学仪器有限公司;YXQ- LS-50SII立式高压灭菌器，上海博迅实业有限公司;FA2004电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司;SW-CL-2FD净化工作台，上海谱振生物科技有限公司等。

1.2  方法

1.2.1  白千层精油化学成分分析  采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对白千层精油进行化学成分分析，在华南农业大学测试中心完成。样品的处理：取1 μL挥发油，用无水乙醚稀释成1 mL溶液，采用GC-MS对挥发油进行分析。GC条件：石英毛细管柱HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）程序升温，起始温度为40 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升温180 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升温速率，升温到260 ℃，然后保持至完成分析，载气为He（99.99%），柱流量 1. 0 mL/min，压力28.8 kPa，进样口温度250 ℃，不分流。MS条件：EI源，电子能量为70 eV，接口温度为250 ℃，離子源温度为230 ℃，采集质量范围35～-500 amu。样品经气相色谱质谱分析，各分离组分采用NIST14谱库检索（匹配度大于90%），并结合人工解析和参考文献加以确认其化学成分。相对含量采用色谱峰面积归一化法计算。

1.2.2  白千层精油抑菌活性测定方法  用琼脂稀释法结合菌丝生长速率法[26]，测定白千层精油对供试病原真菌菌丝生长的抑制作用。用移液枪准确吸取适量精油与0.1%吐温--80无菌水溶液混合，充分乳化后加入到10 mL已冷却至50 ℃的PDA培养基中，配制得到2.5、5.0、7.5、10.0 µL/ml 4个浓度处理，反复振荡摇匀后小心倒入无菌培养皿，制备不同浓度的PDA培养平板。以仅加入0.1%吐温--80无菌水溶液的PDA培养基为空白对照处理。取在PDA平板上预先培养的供试病原菌，从菌落边缘用直径8 mm的无菌打孔器切取菌饼，并将其移植到上述不同体积分数的精油平

板和空白对照中央。每个处理3次重复。将培养皿置于28 ℃的恒溫培养箱内培养6 d。从第2 d开始，用相交垂直线法每2 d测量一次供试菌菌落的直径，并对结果进行统计分析。按下列公式计算菌丝生长抑制率。

参照马萱等[27]方法，通过抑制率的大小判定白千层精油对各菌落的抑菌活性等级：相对抑制率达70%以上为较强抑制;相对抑制率达40%～ 70%为中等强度抑制;相对抑制率达40%以下为较弱抑制。

1.3  数据处理

实验数据采用Excel软件整理，SAS软件统计分析，差异显著性采用邓肯氏新复极差法检验（DMRT，p<0.05）。

2  结果与分析

2.1  白千层精油化学成分GC-MS分析

通过GC-MS分析白千层精油的化学成分，并通过标准图谱库对比和检索图谱分析，鉴定出74种化学成分，并计算出各成分的相对含量，鉴定出匹配度90%以上的化合物含量占总挥发油成分的97.28%。测得的化学成分涵盖了烯、醇、酮类。由表1可知，白千层精油中较大峰的保留时间分别在7.427、9.104、10.616、11.153、12.372、15.079和26.195 min，其化学成分分别是左旋-α-蒎烯（2.07%）、β-月桂烯（1.05%）、1，8-桉叶素（67.29%）、萜品烯（2.52%）、芳樟醇（2.36%）、 α-松油醇（7.93%）和（+）-g-桉叶油醇（1.26%），这7种化合物总含量占到总挥发油成分的84.48%。

2.2  白千层精油对4种植物病原真菌的抑菌活性

从图1和表2可以看出，白千层精油处理对小孢拟盘多毛孢菌、立枯丝核菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌均表现出较强的抑菌活性。从图1可以看出，处理6 d，对照处理的小孢拟盘多毛孢菌、立枯丝核菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌菌丝体几乎长满了整个培养皿（（图1中A0、B0、C0、D0）图1中A0、B0、C0、D0），而白千层精油各浓度处理的4种植物病原菌菌丝生长均明显小于对照（（图1中A1～A4、B1～B4、C1～C4、D1～D4）图1中A1～A4、B1～B4、C1～C4、D1～D4）。

从表2可以看出，白千层精油对立枯丝核菌菌丝生长具有更强的抑菌活性。白千层精油处理2 d，在2.5～10.0 µL/mL浓度处理的菌丝生长抑制率均达到100%。在2.5～5.0 µL/mL时，白千层精油除了2.5 µL/mL浓度处理的菌丝生长抑制率降为85.87%外，其他浓度处理对立枯丝核菌菌丝生长的抑菌率均为100%，表现出很好的抑菌持效性。

处理2 d时，白千层精油在2.5～10.0 µL/mL浓度下对小孢拟盘多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌的菌丝生长抑制率达71.59%以上，其抑菌作用均随着处理浓度的增加而增强，表现出明显的浓度效应。随着白千层精油处理时间的延长，对3种植物病原菌仍然表现出较强的抑菌活性。处理4～6 d时，白千层精油除了2.5 µL/mL浓度处理外，其余各浓度处理的菌丝生长抑制率均在70.82%以上，表现出对小孢拟盘多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌等3种植物病原菌较好的抑菌持效性。

从表2可以看出，白千层精油处理2 d时，2.5 µL/mL下4种病原真菌间的抑菌作用差异显著，对立枯丝核菌的抑制率达100%;5.0 µL/mL下立枯丝核菌与另外3种病原真菌间的差异显著;7.5 µL/mL、10.0 µL/mL对4种病原真菌表现出完全抑制效果。处理4 d和6 d时，仍以对立枯丝核菌的抑制效果最佳，不同病原真菌间的抑制效果存在不同差异。

3  讨论

本文研究采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用（GC-MS）手段分离鉴定出白千层精油含有74种化学成分，占总挥发油量的97.28%，其主要化学成分是1， 8-桉叶素（（67.29%））、α-松油醇（（7.93%））、萜品烯（（2.52%））、芳樟醇（（2.36%））、左旋-α-蒎烯（（2.07%））、（+）-g-桉叶油醇（（1.26%））和β-月桂烯（（1.05%））等。本文白千层精油检出的成分及其含量与文献存在一定差异，刘布鸣等[28]从白千层挥发油中检出确认了35种成分，其主要化学成分为松油醇-4（（33.58%））、α-松油烯（（10.12%））、1， 8-桉叶素（（6.08%））、γ-松油烯（（18.05%））、β-月桂烯（（1.05%））等;董晓敏等[29]从广西产白千层的挥发性成分中确认了47种成分，主要化学成分包括1， 8-桉叶素（（40.64%））、α-蒎烯（（14.74%））、α-松油醇（（8.71%））、愈创木醇（（4.30%））、石竹烯（（3.63%））、喇叭茶醇（（2.14%））、石竹烯氧化物（（1.92%））、β-蒎烯（（1.69%））等;海口产的白千层枝和叶的挥发油主要成分和含量也存在差异，白千层枝的挥发油中以芳樟醇（（3.79%））、桉叶油醇（（2.31%））、β-松油醇（（2.22%））、α-杜松醇（（2.19%））、β-蒎烯（（2.13%））、α-松油醇（（1.78%））、α-蒎烯（（1.04%））、松油醇-4（（1.02%））、绿花白千层醇（（1.01%））等为主，而白千层叶挥发油主要成分为松油醇-4（（27.43%））、1， 8-桉叶素（（19.37%））、α-松油醇（（8.27%））、石竹烯（（3.79%））、β-蒎烯）（1.39%））、α-蒎烯（（1.24%））等[30]。这些差异的存在可能与白千层产地环境、栽培时间、采集时间、采集部位、测定条件等有一定关系。本精油中1， 8-桉叶素的相对含量高达67.29%，而松油醇-4（（即4-萜品醇））只有0.78%，故属于桉型茶树油[31]。1， 8-桉叶素广泛用于食品、医药、日用化工等领域，具有明确的药用价值和一定的消耗量[32];研究发现1， 8-桉叶素在50 μg/mL对沙门氏菌（Salmonella enteritidis）有抑制效果，是茶树油的主要抑菌成分[33];钟振声等[22]认为1， 8-桉叶素为抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的有效物质。α-松油醇对多种革兰氏菌和多种真菌具有较强的抑制作用[34-36]，如α-松油醇能明显抑制意大利青霉菌丝体生长[37]。实验证明芳樟醇有显著的抑菌活性[38-39]，天然芳樟醇对柑橘炭疽病菌、苹果炭疽菌、番茄灰霉菌和小麦赤霉菌表现出较强的抑菌活性[40-41]，薰衣草精油组分芳樟醇对抑制金黄色葡萄球菌贡献最大[42]。α-蒎烯对白念球菌有明显的抑菌和杀菌作用[43]，研究发现20 µL/mL的1s-α-蒎烯可完全抑制大肠杆菌;50 µL/mL的1s-α-蒎烯、β-月桂烯可完全抑制枯草芽孢杆菌生长[44]。

本文研究结果表明，白千层精油对立枯丝核菌、小孢拟盘多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌等4種植物病原菌的生长均具有较强的抑制作用，抑菌作用随精油浓度的增大而增强，且具有较好的持效性。白千层精油处理立枯丝核菌，在5.0～10.0 µL/mL浓度范围均可完全抑制立枯丝核菌菌丝生长;在7.5～10.0 µL/mL浓度范围可完全抑制小孢拟盘多毛孢菌菌丝的生长;在10.0 µL/mL浓度时可完全抑制水稻稻瘟菌菌丝的生长。其余浓度处理下，白千层精油对立枯丝核菌、小孢拟盘多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌等4种植物病原菌的生长均具有较强的抑制作用。张丽等[19]和朱德明等[17]的研究结果显示互叶白千层精油对芭蕉炭疽菌、香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌具有良好的抑菌效果，能显著性抑制芭蕉炭疽菌菌丝生长，可导致其分生孢子内部构造发生改变。陶凤云等[18]研究结果表明白千层精油对水稻恶苗菌、尖孢镰刀菌和水稻纹枯菌等3种植物真菌菌丝生长的抑制作用显著。由此可见，白千层精油抗菌抑菌活性具有一定的广谱性，可作为开发新型抗菌抑菌剂的来源材料。

本文开展了白千层精油化学成分研究分析和其对4种常见植物病原真菌的抑菌活性测试，但白千层精油对其他植物病原菌的抑菌活性、最小抑菌浓度、杀菌机理以及白千层精油中存在抑菌活性的单体化合物筛选确定等方面问题还需要在后续工作进行深入研究。

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