核酸疫苗在水产养殖业中的应用研究现状

近年来随着人们对水产品需求量的增加，水产养殖业得到了快速的发展。但大规模高密度养殖造成的水环境污染，致使水产病害日趋严重，特别是病毒性疾病造成的损失更是惊人。目前，养殖者大多使用化学合成或抗生素类药。由于药物残留、诱变抗药菌株及水体污染等副作用，导致了我国水产品在出口时遇到种种障碍，严重阻碍了养殖业的发展。因此，采用疫苗预防水产动物疾病，成为各国研究者关注的重要内容。

1核酸疫苗的发现

鱼用疫苗可分为三种类型：第一种为减毒及灭活疫苗；第二种为重组亚单位疫苗和合成多肽疫苗；第三种是核酸疫苗。第一、二种疫苗虽然在生产实践中得到了较大程度的应用，然而在生产成本、效价稳定性、保护力等方面还存在一定的问题。1990年，Wolff等发现将质粒脱氧核糖核酸（裸露的脱氧核糖核酸）注射给小鼠能引起外源基因的长期表达；Ulmer等进一步证实，将病毒蛋白基因注射给动物能引起免疫反应。由此，诞生了脱氧核糖核酸免疫技术，使得核酸疫苗成为继减毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗和重组多肽疫苗之后的又一新型疫苗，誉为第三次疫苗革命。

有关鱼类核酸疫苗的报道最早见于1996年。Anderson等和Gomdz-Chiari等的实验分别证明了向鱼体注射带病基因的DNA疫苗能引起鱼体产生免疫反应。Anderson等给虹鳟注射含IHNV病毒糖蛋白基因的质粒脱氧核糖核酸，使虹鳟对IHNV产生了抗性。鱼类DNA疫苗的研究工作起步较晚，目前主要集中在鲑、鳟鱼类的IHNV、VHSV、杆状病毒（SVCV）、鲤春病毒（SHRV）等传染性病毒病的防治上。但已经取得了令人鼓舞的成就。挪威已批准使用一种可注射的、用病毒蛋白VP3制作的抗IPN疫苗。该疫苗对入海前的小鲑和养殖场中突发的鲑鱼病有防御作用。IHHNV疫苗也已通过G蛋白获得，该疫苗在实验室和现场实验中均获得了良好的防御效果。

2核酸疫苗的免疫机理

鱼类的免疫防御包含两道防线，第一道防线是鱼体的非特异性免疫系统，包括物理屏障（如粘膜表层和皮肤）、多种白细胞（如单核细胞、巨嗜细胞、粒细胞和非特异性细胞毒细胞等）和免疫活性物质（如溶菌酶、干扰素、C-反应蛋白、铁传递蛋白、凝集素及补体等），这种非特异性免疫系统对鱼类免疫防御起着关键作用；第二道防线为特异性免疫系统，分为体液免疫和细胞免疫两种。

核酸疫苗又称基因疫苗或DNA疫苗，由含保护性抗原基因的质粒构成，导入机体后被宿主细胞摄取、表达、加工并提呈给免疫系统诱导特异性体液免疫和细胞免疫。

2.1核酸疫苗诱导的体液免疫

核酸疫苗能够诱导鱼体内抗原特异性免疫蛋白的产生。Kanellos等（1999）将含有巨细胞病毒启动子（CMV）和许多基因的质粒（PCMV-LacZ）通过肌肉接种到金鱼体内，7d后便在其体内检测到了β-半乳糖苷酶的存在；尽管免疫几周后抗体形成细胞的数量快速衰减，但血清中抗体浓度能维持3～8周的高峰期。Boudinot等（1998）以含有病毒性出血败血症病毒（VHSV）的G蛋白基因的质粒注射虹鳟，23d后在其体内检测到了蛋白抗体的存在。在最初的DNA疫苗试验中，只在免疫虹鳟体内检测到少部分的血清发生转化（2/15），而之后的试验则在免疫鱼体内检测到了较高的抗体水平。

2.2核酸疫苗诱导的细胞免疫

动物淋巴细胞增殖试验证明，当从DNA疫苗免疫的鱼体内分离隔离出来肾脏白细胞，并在免疫后不同时间内注入鱼体时，该肾脏白细胞仍能获得免疫活性。1998年Boudinot等采用真核表达载体pCDNA以及巨细胞病毒（CMV）启动子分别构建了VHSV和IHNV糖蛋白基因的DNA疫苗，单独或联合给虹鳟成鱼进行肌肉注射，结果发现注射45天后仍能在肌细胞里检测到质粒脱氧核糖核酸，在疫苗注射部位还检测到了Mx蛋白和主要组织相容性抗原（MHC）Ⅱ类分子的RNA。Mx蛋白是一种干扰素诱导因子，其检出说明鱼体产生了抗病毒的非特异性免疫反应。MHCⅡ类分子只在巨噬细胞或树突状细胞等专门的抗原呈递细胞表面存在，二者的生成说明DNA疫苗对鱼体非特异性免疫和细胞免疫均具有诱导作用。此外，抗原蛋白的表达还能诱导淋巴细胞分化出细胞毒素T淋巴细胞（CTLs），CTLs能杀死病原细胞或通过非细胞溶解方式抑制病原菌感染。

3 核酸疫苗的构建

构建核酸疫苗的关键是保护性抗原基因的筛选和载体的选择。

3.1保护性抗原基因的筛选

保护性抗原基因的筛选是通过比较不同保护性抗原编码基因在被免疫对象体内的表达与诱导免疫保护力的情况，筛选有效的基因作为目的基因。其筛选方法有：共价血清免疫筛选法；表达文库免疫筛选法；直接将亚单位疫苗或合成多肽疫苗的编码基因作为候选基因等。

3.1.1共价血清的免疫筛选

病原微生物的表达型文库可用特异性抗体-免疫学探针进行筛选。通过影印法将文库转移到硝酸纤维素膜上，用特异性抗体在膜上进行免疫结合反应，再与放射性标记的二抗结合，进而找出带有示踪讯号的斑点。或通过酶标抗体与底物显色筛选目的克隆。

3.1.2表达文库免疫筛选法（ELI）

表达文库免疫筛选法是用病原的基因组表达型文库逐级分组免疫动物，通过攻毒实验获取候选基因或候选基因片段的一种方法。Barry等最先报道ELI，这种方法常被用来筛选寄生虫的候选基因。Alberti等用克氏锥虫（Try-panosoma cruzi）的表达文库免疫小鼠，结果在小鼠体内检测到特异性的IgG。Piedrafita等用同样的方法从利氏曼原虫（Leishmania major）基因组表达文库中最终筛选到五个具有保护力的克隆，Melby等则筛选到杜氏利氏曼原虫（Leishma-nia donovani）的组蛋白和核糖体蛋白能够诱导动物机体产生病原特异性的T细胞免疫应答反应。

不同于共价血清免疫筛选，表达文库免疫筛选既能诱导体液免疫又能诱导细胞免疫，并且在筛选过程中细胞毒性T淋巴细胞的靶位不会被丢失。ELI在不清楚抗原性靶位研究背景的情况下，可以筛选到病原基因组中的每一个可能的基因。

3.1.3其他筛选方法

直接将亚单位疫苗的编码基因作为核酸疫苗的候选基因。病毒的保护性免疫应答是由包裹病毒的表面多肽或从病毒表面突起穿过脂质囊膜的多肽激发的，可将编码这些免疫原的基因直接作为候选基因。另外，毒力是病原微生物致病性的根本原因，诱导针对主要毒力抗原决定族的免疫力是建立免疫保护的另一种重要手段。

3.2核酸疫苗载体设计

鱼类采用哺乳动物表达载体，如pcDNA3.1（+/-）作为表达外源基因的质粒骨架，标准载体中的转录控制序列（启动子、增强子、内含子、Poly-A信号等）在水产动物中同样有效。载体的属性，如不相关的Th表位，CpG motif，共线性表达的细胞因子或共刺激分子都通过核酸疫苗体现。如将小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）基因与抗原编码基因构建在同一个质粒载体上免疫鲫（Carassius auratus），诱导鲫产生细胞介导的免疫应答。

启动子是驱动外源基因在宿主细胞中表达的主要元件。在各种各样的启动子中，以人巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）早期启动子效果最好，使用也最广泛。这种启动子能使外源基因在有鳍鱼类中高水平表达。为了构建水产动物核酸疫苗安全而高效的表达载体，Gómez-Chiarri等比较了CMV与两种鱼源启动子—鲤β-肌动蛋白和花（Fundulusheteroclitus）乳酸脱氢酶β-启动子驱动萤火虫荧光素酶基因在鲑（Salmo salar）肌肉中的表达情况。结果CMV和β-肌动蛋白启动子都能使荧光素酶基因高水平表达，β-肌动蛋白启动子较CMV效果稍差，但差异不显著。β-肌动蛋白启动子在很多组织和细胞中都诱导到外源基因较高水平的表达，因而成为水产动物核酸疫苗载体构建过程中病毒启动子的安全而高效的替代元件。

4核酸疫苗的免疫接种方法

核酸免疫接种途径包括直接注射裸DNA、基因枪导入法和浸泡等。

4.1肌肉注射

核酸疫苗主要是通过肌肉注射接种的。虽然注射免疫劳动强度大并会对鱼体造成很大胁迫，但其免疫效果往往却是最好的。肌肉注射能诱导疫苗基因的强而持久的表达。

4.2基因枪免疫

通过基因枪将少量核酸疫苗导入皮下可以有效地诱导免疫应答。其原因是皮下存在大量的APC。免疫反应发生时APC被转染并表达抗原蛋白，从而表现出极高的抗原呈递效率。Tucker等以绿荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）为报告基因评估基因枪免疫时不同psi对鱼体损伤程度及对接种效率的影响，结果200psi的综合效果最好。Hansen等的研究也表明基因枪能够直接将包被核酸疫苗的微颗粒导入靶细胞，而肌肉注射时大多数核酸并没能到达靶细胞。

4.3浸泡和超声波相结合法

给虹鳟幼鱼接种VHSV核酸疫苗，以GFP作为报告基因比较浸泡-短脉冲超声导入法与DOTAP脂质体共转染导入法的免疫效果，结果以前者的GFP表达量为高，并能使机体获得对VHSV的保护力。可见，短脉冲低强度超声导入是一种针对鱼苗的非常实用的接种方法。

4.4弱毒株介导的免疫接种

细胞内寄生的弱毒株不仅被用于预防其本身的感染，还可作为异源抗原的载体，构建成携带核酸疫苗的活疫苗。通过口服形式即可以稳定、持续、高效地表达外源抗原，获得相应的细胞免疫和体液免疫。单核细胞增生性利斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）能够感染鱼是一细胞系如鲤上皮瘤细胞系（EPC），胚胎细胞系（A2），黑色素瘤细胞系（PSM），且其一旦从宿主细胞的吞噬体中逃逸出来，其本身的actA启动子就会被激活并表达L.monocytogenes特异性的抗菌素细胞溶解酶，致使菌体发生自溶，并可使转化到菌体中的核酸疫苗直接进入到宿主细胞质中。用转化有pAct-gfp的L.monocytogenes感染这些细胞系，24h后就可在这些细胞的胞质溶胶中检测到绿荧光蛋白的表达，更重要的是actA启动子在低温下也具有活性。可见，L.monocytogenes既可介导温水鱼又可介导冷水鱼的疫苗接种。

4.5鱼类胸腺介导的免疫接种

胸腺是鱼类重要的淋巴器官。鱼类的胸腺上皮细胞具有吞噬功能，且胸腺中存在有大量的巨噬细胞、粒细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞等，故胸腺上皮细胞能够有效地呈递抗原。抗原呈递细胞介导的核酸免疫能够产生高效的免疫保护，如以电脉冲法将肥头带绦虫（Taeniacrassiceps）囊尾蚴的cDNA表达文库转化到巨噬细胞，并以这样的巨噬细胞进行免疫接种，能够产生了高的保护力，同时受免动物体内出现抗原特异性脾细胞增殖反应；用编码疱疹单一病毒两个糖蛋白的基因构建的核酸疫苗体外转染树突状细胞，并以这样的细胞为免疫原进行免疫，也诱导到高水平的免疫保护力。更重要的是Maloy等将核酸疫苗直接注射到哺乳动物的外周淋巴结中，可以使免疫效果增强100～1000倍，并诱导强的CTL反应。

5核酸疫苗的安全性

核酸疫苗还有一些不完善的地方，如抗DNA抗体、免疫耐受、自身免疫、过敏反应、局部注射部位损伤、炎症反应，全身性组织毒性和遗传及繁殖毒性等。对于DNA可能会整合到宿主细胞的染色体上而造成插入突变的问题，但到目前为止，完成的诸多研究并未发现有插入突变的现象，其频率甚至比自发突变发生的频率还要低100倍。在鱼用疫苗的应用试验上至今还没发现质粒整合入宿主染色体基因组现象的发生，质粒DNA在鱼体内会缓慢降解，用ELISA免疫印迹放射免疫分析DNA免疫鼠，均未检测到DNA抗体，未造成动物的自身免疫性疾病，也不随卵和精子传入子代鱼体内，它随生物链进入其他鱼种和动物体内时会失活，而且对环境的污染很小，因此其危险性远低于现用的其他疫苗。外源DNA一般来自于细菌培养物，其质粒载体上常含有抗生素基因，在动物体内是否表达并产生作用、制品中是否含有内毒素、质粒是否以超螺旋形式存在等，也都是应该考虑的安全性问题。

6鱼用核酸疫苗的研究展望

早期核酸疫苗的研究主要以哺乳动物为模型，后来发现鱼类细胞同样能够有效地表达由真核表达载体携带的外源蛋白基因，诱导产生体液免疫反应而生成抗体，也能产生细胞介导的免疫反应，因此开始将核酸疫苗应用于鱼类。但由于鱼类免疫系统的研究还不够深入，鱼类病原抗原基因的研究工作也还不多，所以鱼用核酸疫苗的作用机制和抗原基因的分离还有待于进一步探索。在国内除对草鱼呼肠孤病毒、鲤春病毒有一定的研究外，鱼类主要病原表面抗原的分子生物学基础研究还亟待加强。此外，优化核酸疫苗效率、降低疫苗生产成本、研究非注射方式接种，使之适合规模化生产等，都是影响其应用前景的重要因素。此外，发展能抑制多种病原体的多价疫苗十分重要。相信未来将会制备和生产更多的高效安全、使用方便的核酸疫苗，促进我国水产养殖业的发展。

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