谷胱甘肽S—转移酶P1基因多态性与胃癌发展的相关性研究

[摘要] 目的 分析谷胱甘肽S-转移酶（glutathione-S-transferase GSTs）P1基因多态性与胃癌发展的相关性，探讨高风险GSTP1-Val等位基因在氧自由基致胃癌中的作用。 方法 以血液样本、胃癌细胞和相应正常胃黏膜细胞样本为实验材料，采用放射免疫分析法（RIA）测定血浆谷胱甘肽S-转移酶P（GSTP）的含量和活性改变；多聚酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测外周血DNA GSTP1的多态性。 结果 胃癌、肠上皮化生和不典型增生两种癌前病变组织中GSTP染色的阳性率分别为78.00%（39/50）、48.00%（24/50）和74.00%（37/50），与正常胃黏膜比较差异有统计学意义（P < 0.05）；GSTP在胃癌时升高[（27.5±24.5）μg/L]，明显高于正常人组[（7.1±2.3）μg/L]，两组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）；GSTP在癌前病变组[（16.8±12.3）μg/L]高于正常人组（P < 0.01）；GSTP含量与肿瘤的分化程度呈正相关（r = 0.914，P < 0.01）；高分化及中分化管状腺癌的阳性率分别为72.73%（8/11）和100.00%（21/21），高于低分化管状腺癌（58.33%），分化程度与GSTP表达呈正相关（r = 0.732，P < 0.01）。Val 105的酶代替具有Lle 105的酶对多环芳烃二醇环氧化作用的效力高7倍，说明携带Val等位基因的个体患胃癌危险性明显高于非携带Val等位基因个体。 结论 GSTP是机体损伤解毒的酶，它与肿瘤的发生、发展有关，是肿瘤早期诊断有价值的标志酶；GSTP1基因多态性与胃癌发展相关。携带GSTP1 Val等位基因的个体胃癌发病风险增高。

[关键词] 高风险GSTP1-Val等位基因；氧自由基；胃癌；谷胱甘肽转移酶类； 癌前状态

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（b）-0046-04

谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）是在肝脏中参与生物转化第二相反应的一种生物酶[1]。谷胱甘肽（GSH）在肝细胞液GST催化下，可与许多卤代化合物和环氧化合物结合，生成含GSH的结合产物。GSTs与毒物包括致癌物代谢解毒有关[2]。GSTP1是GSTs超基因家族中P家族的重要成员，该基因位点突变后可降低酶活性，使机体排毒功能减弱，增加肿瘤危险性[3]。随着现代细胞分子生物学理论和技术的发展，通过对DNA重组、限制性长度多态性分析和基因转染等对癌症进行了大量研究工作，现已明确异常基因在癌变过程的不同时期影响细胞异型增生，癌细胞的分化程度、浸润和转移。本文主要分析GSTP1多态性与胃癌发展的相关性，探讨高风险GSTP1-Val等位基因在氧自由基致胃癌中的作用。现分析如下：

1 材料与方法

1.1 标本收集与处理

标本来源于沈阳医学院奉天医院2010年7月～2012年7月胃癌手术切除标本，以患者自身的癌远端正常组织作为正常对照，共50例。其中男32例，女18例，年龄27～72岁，其中，年龄<50岁19例，50～<60岁20例，≥60岁11例。全部病例均经病理证实，分化程度：高分化腺癌11例，中分化腺癌21例，低分化腺癌12例，未分化腺癌4例，黏液腺癌2例。临床分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期20例，Ⅲ期21例，Ⅳ期5例。标本离体后，立即取材，-70℃贮存。另收集病理教研室存档的胃石蜡标本150例，肠上皮化生50例，不典型增生50例，健康体检者50例。每例右蜡标本连续切片，厚度SUM，进行常规染色，病理学诊断和GST-单抗免疫组化染色。

1.2 GSTP的含量和活性测定

采用放免法（RIA），血浆经抗凝的硅化管在4℃下3000 g离心30 min，20 ℃保存备用。每管加洗液2 mL， 4℃离心，300 g 30 min，去除上清，测沉淀物的放射性强度标准曲线和标准品GST，从100 μg/L倍比稀释至1.56 μg/L，零标准管为纵坐标，标准曲线和标准品GST，从100 μg/L倍比稀释至1.56 μg/L，零标准管为纵坐标，标准品为横坐标。采用实时定量RT-PCR检测方法，首先取50例胃癌患者手术切除原发癌灶、自身正常胃、转移淋巴标本制成连续冰冻标本切片，进行染色、封片及病理诊断，胃黏膜上皮细胞数>5个为GSTP阳性，反之则为GSTP阴性作为判断标准。

1.3 GSTP1基因多态性的检测

抽取外周血5 mL，常规酚-氯仿法提取DNA。采用PCR-RFLP法进行基因多态性检测：引物序列5′-ACCCCAGGGCTGTATGGGAA-3′和5′-TGAGGGCACAAGAAGCCCCT-3′，扩增后的PCR产物用BsmAⅠ限制性内切酶进行消化。PCR反应体系：分别加10×Buffer（含各0.5 μL，Taq DNA酶0.4 μL，模板DNA 1 μL），加去离子水至总体积50 μL。30 s，循环35次后，72℃延伸10 min。酶切反应体系：NET buffer 2 μL，内切酶0.5 μL，PCR产物DNA 12 μL，加双蒸水至总体积20 μL。将其置于37℃恒温箱中，酶切3 h。取酶切产物20 μL于2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色5 min后观察DNA条带。随即对几个GSTP1基因多态型的PCR产物进一步纯化，以ABI377型测序仪行DNA序列测定[5]。

1.4 统计学方法

全部数据用Foxbase建立数据文件，然后用SPSS 11.5 统计软件包进行分析。所有统计检验均为双侧概率检验。计数资料比较则采用χ2检验。计量资料采用t检验，采用多组间比较的方差分析，两两比较采用LSD-t检验，胃癌的分化程度与GSTP含量及表达的相关性检验采用Spearman等级相关分析，单因素分析采用Log-rank检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆GSTP含量

胃癌、肠上皮化生和不典型增生两种癌前病变组织中GSTP染色的阳性率分别为78.00%（39/50）、48.00%（24/50）和74.00%（37/50）。与正常胃黏膜比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 血浆GSTP含量

GSTP在胃癌组织中含量[（27.5±24.5）μg/L]明显高于正常胃黏膜[（7.1±2.3）μg/L]，两组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）；GSTP在癌前病变组织中含量[（16.8±12.3）μg/L]高于正常胃黏膜（P < 0.01）；GSTP含量与肿瘤的分化程度呈正相关（r = 0.914，P < 0.01）。

2.3 胃癌分化程度与GSTP阳性率

GSTP在胃癌中的表达与其组织类型及分化程度密切相关，高分化及中分化管状腺癌的阳性率分别为72.73%和100.00%，高于低分化管状腺癌58.33%，说明分化程度与GSTP表达呈正相关（r = 0.732，P < 0.01）。见表2。

2.4 GSTP1基因多态性的检测

GSTP1第5外显子的一个位点的A→G突变导致两个氨基酸的酶的活性部位被取代即异亮氨酸（Lle 105）转变为缬氨酸（Val 105），Val 105转变为丙氨酸。2.5%琼脂糖凝胶电泳可见Val 105 Val纯合子多态基因型；A/G杂合状态下可见Lle 105 Val杂合子多态基因型；无多态者则表现为Lle 105 Lle纯合子野生基因型。实验酶切后出现3个基因片段，且分子量不同，分别为329、222、107/104 bp（图1）。Val 105 的酶代替具有Lle 105 的酶对多环芳烃二醇环氧化作用的效力高7倍，GSTP1基因多态性的检测结果提示，基因产物的活性和对底物特异性发生改变，可能导致基因损伤和导致胃癌的易患性。

3 讨论

胃癌的病因迄今尚未完全阐明，近年大量研究资料表明幽门螺旋杆菌（H·pylori）感染与胃癌发病有关。H·pylori感染致胃癌确切机制不清，可能由于H·pylori感染造成胃黏膜炎性细胞浸润，使氧自由基增多及多种细胞因子释放，引起的急慢性炎症不仅增加了DNA损伤的机会，而且所释放的氧自由基也提高了细胞恶变的概率[6-8]。自由基又称游离基，是指化合物的分子在光热等外界条件下，共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团。氧分子是一种稳定的双自由基（可以表示为·O-O）。因为电子自旋平行，氧分子很稳定。当稳定基态氧分子（三线态氧）激发后，形成极度活泼的的单线态氧[9]。人体正常代谢及病理条件下中产一氧自由基。越来越多的研究显示氧自由基参与上的发生、发展及转归等各个过程[10]。更新的研究表明，氧自由基可以促使人类的大敌——癌症得以逆转，即癌细胞再分化正常或接近正常的细胞[11]。

研究发现自由基参与了癌变的两个主要阶段——诱癌和促癌。在致癌物质的作用下，相应人体靶组织发生物理化学的反应，产生自由基，就有可能诱发该组织癌变，过多的自由基体内堆积以及体内癌变组织异化，又促进了癌肿的生长的发育。癌症与自由基自从发现自由基引起肿瘤细胞扩散后，自由基与癌症关系的研究受到广泛重视。致癌物在体内引发自由基，攻击遗传物质DNA，从而发生癌症[12]。自由基作用于脂质，产生的过氧化产物既能致癌又能致突变，致癌和致突变在分子水平上的机制是相同的。促癌阶段也与自由基有关，促癌能力与其产生自由基的能力相关。GSTs是指催化具有亲电取代基的外源性化合物与内源的还原GSH反应的酶。可催化多种反应包括烃基、芳基、芳烃基、烯基和氧基的转移反应。GSTs主要分布于人和动物的肝细胞浆中，主要包括4个家族：A、M、T、P（按旧命名系统分别为α、μ、θ、π）。其中GSTP被认为是多种肿瘤的标志物[13]。GSTP1是人体内GSTs的一种重要的活性亚型。GSTP1是哺乳动物体内一种重要的解毒酶，参与维持了机体内氧化还原状态的平衡。相关研究认为GSTP1与一些人类环境致癌剂的体内代谢反应有关[14]。本研究表明胃癌、肠上皮化生和不典型增生两种癌前病变组织中GSTP染色的阳性率分别为78.00%（39/50）、48.00%（24/50）和74.00%（37/50），与正常胃黏膜比较差异具有统计学意义（P < 0.05）；GSTP在胃癌组织中升高，明显高于正常胃黏膜，两组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）；GSTP在癌前病变组高于正常胃黏膜（P < 0.01）；GSTP含量与肿瘤的分化程度呈正相关（r = 0.914，P < 0.01）；高分化及中分化管状腺癌的阳性率分别为72.73%和100.00%，高于低分化管状腺癌58.33%，说明分化程度与GSTP表达呈正相关（r = 0.732，P < 0.01）；而GSTP1第5外显子的一个位点的A→G突变导致两个氨基酸的酶的活性部位被取代即异亮氨酸（Lle 105）转变为缬氨酸（Val 105），Val 105转变为丙氨酸。Val 105 的酶代替具有Lle 105 的酶对多环芳烃二醇环氧化作用的效力高7倍，GSTP1基因多态性的检测结果提示，GSTP1基因多态性与胃癌发展相关。携带GSTP1 Val等位基因的个体胃癌发病风险增高。

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（收稿日期：2013-02-22 本文编辑：郝明明）

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