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埃里格孢的生物学特性及致病性初步研究

时间:2022-04-07 10:28:32  浏览次数:

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1.1材料

从鳜鱼的鳃部分离到的菌株,在PDA培养基上纯培养,将纯培养的菌种保存于4 ℃冰箱备用。

1.2方法

1.2.1菌株的分离鉴定提取菌株DNA,扩增其18S rRNA基因。扩增使用的引物是通用引物NS1与NS6[2],将菌株的18S rRNA基因序列输入GenBank数据库中,查找相似菌种。将真菌接种到PDA培养基上,25 ℃恒温培养 3~12 d,每天观察菌落形态与颜色。再在显微镜下观察其产孢结构,分生孢子梗着生情况,孢子形态、大小与颜色等。采用分子鉴定和形态鉴定方法与步骤,具体步骤见文献[3]。

1.2.2不同pH值对埃里格孢的影响供试pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的PDA平板,共7个处理,平行做3次。切取菌龄一致的菌饼(直径8 mm),将其置于平板中央,在28 ℃下恒温培养,观察并记录菌落的生长速率,培养24 h后采用十字交叉法测定菌落直径[4],试验周期为7 d。

1.2.3不同温度对埃里格孢的影响供试温度为5、10、15、20、25、30、35、40 ℃共8个温度梯度,平行培养3次,切取菌龄一致的菌饼(直径8 mm),将其置于平板中央,在28 ℃下恒温培养,观察并记录菌落的生长速率,培养24 h后采用十字交叉法测定菌落直径,试验周期为7 d。

1.2.4埃里格孢的致病性用埃里格孢回复感染草鱼和鲤鱼,提前买一批供试鱼,等到供试鱼在自然条件下生长稳定,开始进行回复感染。将鱼分装到养鱼箱中,每箱数量为10尾,平行做3次,1箱对照组,2箱试验组。对照组不进行任何处理;试验组用浸泡法(在鱼的胸鳍处用小刀割1个3~5 cm长的小口,将PDA平板上生长的埃里格孢菌丝和分生孢子用刷子刷入养鱼箱中)和涂抹法(在鱼的胸鳍处用小刀割1个3~5 cm长的小口,用灭菌棉签沾取埃里格孢的分生孢子涂抹于伤口处)处理草鱼和鲤鱼,试验周期为15 d,观察埃里格孢的致病性。

2结果与分析

2.1埃里格孢的鉴定结果

将菌株的18S rRNA基因序列输入GenBank数据库中,经过用Blast工具比对,该菌株属于埃里格孢属。

经过形态观察,菌丝体表生至埋生;菌丝无色,具隔膜,壁光滑,宽2~4 μm。分生孢子梗直或弯曲,简单或具分枝,褐色至暗褐色,具隔膜,长达70 μm,宽6~8 μm,在上端产孢处屈膝状弯曲,具多个产孢孔,内壁芽生孔式产孢,合轴式延伸。产孢细胞单芽生至多芽生、合生,圆柱状,褐色。分生孢子淡褐色至褐色,单生,壁光滑,倒卵形、卵圆形、椭圆形或近圆柱形,直或形成各种弯曲,呈“乙”形或“S”形等,中间略粗、两端稍细,具多个横隔膜(通常3~6个),横隔膜加厚、色深,分隔处略隘缩,似桶箍状。偶有纵隔膜或斜隔膜,孢子脱落痕明显,(30~40) μm×(10~12) μm,可形成次生分生孢子梗(图1-a)。

分生孢子在水中,25 ℃时4 h左右即可萌发,主要从两端细胞萌发,也可从中间细胞萌发,萌发芽管生长迅速,48 h左右萌发的芽管即可分化形成菌丝或次生分生孢子梗,从上产

生次生分生孢子。次生分生孢子可继续萌发产生细的芽管,其表面常生细小的疣突。萌发的分生孢子细胞可产生1至数个芽管,分生孢子梗亦可萌发产生芽管,多数再很快转变成次生分生孢子梗(图1-b)。

依据形态学特征,结合分子鉴定结果,初步鉴定为丝孢纲(Hyphomycetes)丝孢目(Moniliales)埃里格孢属(Embellisia)埃里格孢(Embellisia allii)[5]。

2.2不同pH值对埃里格孢生长速率的影响

在不同pH值条件下培养,观察pH值对埃里格孢生长的影响。由图2和表1可见,埃里格孢在pH值为5.0~11.0均能生长,差异极显著(P<0.01)(SPSS软件的单样本t检验),表明pH值对埃里格孢的生长影响非常明显。由表1可见,pH值为9.0、10.0和11.0时,菌丝生长速率相对较快,分别为34.45、36.38、36.56 mm/d。

2.3不同温度对埃里格孢的影响

在不同温度条件下培养,观察温度对埃里格孢生长的影响。由表2、图3可见,在5~20 ℃温度范围内,菌丝生长速度随温度升高而增大;在20~35 ℃温度范围内,菌丝生长速率随温度升高而减慢。用SPSS软件的进行单样本t检验,差异极显著(P<0.01),表明温度对埃里格孢的生长影响非常明显。25 ℃和30 ℃生长速率相差不大,菌斑分别达30.74 mm/d和30.57 mm/d,20 ℃生长最快,达38.83 mm/d,可视为最适温度。

2.4埃里格孢的致病性

用浸泡法和涂抹法回复感染草鱼和鲤鱼,15 d之后,试验组的鱼身上没有发现明显的感染症状。

取材进行再培养,没有发现埃里格孢,初步判断埃里格孢对草鱼和鲤鱼无感染能力,单一菌株的埃里格孢可能对淡水鱼无致病性。

3讨论

对从患病鳜鱼身上分离的埃里格孢进行生物学特性的初步研究,将菌株接种到不同pH值的PDA培养基上,于温度25 ℃恒温培养,发现pH值为9.0~11.0时,埃里格孢的生长速率较快(表1)。将菌株接种到PDA培养基上,在不同温度下恒温培养,在温度5~20 ℃范围内,菌丝生长速率随温度升高而增大;温度20~35 ℃内,菌丝生长速率随温度升高而减小,差异极显著;25 ℃和30 ℃生长速度相差不大,20 ℃时埃里格孢生长最快,40 ℃时菌丝几乎不生长(表2)。

陈伟群等报道埃里格孢寄生于大蒜鳞茎,引起黑褐色病斑,后期病斑凹陷失水干燥,表面密生黑色霉层[5],但该菌是否致病于动物还未查到相关报道。本试验是针对从鳜鱼鳃部分离的埃里格孢通过不同温度和不同pH值对它的生长影响来进行生物学特性初步研究后,再以草鱼和鲤鱼为感染对象,用该菌进行回复感染,对其致病性作初步研究,试验结果表明,15 d之后,试验组的鱼身上没有发现真菌埃里格孢,所以埃里格孢对草鱼和鲤鱼可能没有致病性。

据张月星等报道,常见的真菌性鱼病有水霉病、鳃霉病2种[6]。鱼在换水或搬运时体表受伤,局部皮肤坏死,水霉菌便乘机入侵,主要症状为病变部位长着大量棉絮状的菌丝,像一团团的毛,鱼体由于负担过重,游动失常,食欲减退,甚至会瘦弱而死。鳃霉病主要症状为病鱼鳃部呈苍白色,有时有点状充血或出血现象,此病常出现暴发性急剧死亡。埃里格孢单独回复感染草鱼和鲤鱼可能不病致,但与其他真菌一起能否引起鱼类致病还有待进一步研究。

综上所述,该株埃里格孢是从患病鳜鱼的鳃部分离到的,对其进行生物学特性及致病性初步研究,可以了解该真菌是否对淡水鱼具有致病性,在什么条件下会致病,从而为养殖鱼类的真菌性疾病防治提供理论依据,具有很重要的理论意义和适用价值。

参考文献:

[1]张天宇. 中国真菌志:第31卷暗色砖格分生孢子真菌26属[M]. 北京:科学出版社,2009:60-62.

[2]周小玲,沈微,饶志明,等. 一种快速提取真菌染色体DNA的方法[J]. 微生物学通报,2004,31(4):89-92.

[3]魏福伦,朱里鹏,王庆容. 3株鲈鱼体表可疑性致病真菌的分离鉴定与生物学特性[J]. 江苏农业科学,2014,42(1):187-190.

[4]董国菊,申晚霞. 重庆地区玉米圆斑病菌生物学特性的测定[J]. 西南大学学报:自然科学版,2010,32(12):8-13.

[5]陈伟群,张天宇. 中国一新纪录属——埃里格孢属(Embellisia)[J]. 真菌学报,1996,15(2):152-153.

[6]张月星. 观赏鱼真菌性疾病和寄生虫病的中草药治疗[J]. 水产科技情报,2002(4):187-188.刘思思,高旋旋,胡竹青,等. 镉诱导锦鲤肾脏氧化性DNA损伤及谷胱甘肽抗氧化系统改变[J]. 江苏农业科学,2016,44(2):272-274.

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