内生短短芽胞杆菌011可湿性粉剂的研制

摘要以植物内生短短芽胞杆菌011为研究对象，通过对载体、润湿剂、分散剂、稳定剂、保护剂的筛选，确定了内生短短芽胞杆菌011可湿性粉剂最佳配方：滑石粉10%，木质素磺酸钙7%，DBS 3%，CMCNa 2%，糊精0.1%。结果显示制备的短短芽胞杆菌011可湿性粉剂在25 ℃室温下芽胞含量为1.8×1010cfu/g，pH6.8，悬浮率76%，润湿时间52 s，细度通过率98%。能有效降低化学农药在农业生产中的使用率，减少农药对生态环境的破坏。

关键词植物内生菌；短短芽孢杆菌；可湿性粉剂；

中图分类号：S 476.8文献标识码：A

我国每年使用大量的化学农药制剂，容易造成农药残留超标，生物富集，不仅污染生态环境，还影响人类的健康。生物农药副作用小、对人无害，是一种具有广阔前景的绿色农药 日益成为全球农药发展的一种趋势。

近年来研究表明，植物内生细菌对许多植物病原生物具有良好的抑制作用，内生细菌的研究已成为植物病害生物防治的一个研究热点。本研究从烟草植物组织中分离得到一株内生抗菌细菌011，经鉴定其为短短芽胞杆菌[Brevibacillus brevisShida et al.]，GenBank登录号为DQ444285。011菌不仅对烟草青枯病具有良好的防治效果，而且其发酵滤液还对8种植物病原真菌都有抑制作用，其中对番茄早疫病菌菌丝及孢子均有致畸作用，对番茄早疫病菌最低抑菌浓度MIC为30%，有效抑菌中浓度EC50为9.64%，具有很大的生防开发潜力。

目前常规化学杀菌剂防效低，污染环境，而开发活体微生物可湿性粉剂在现代农药制剂中有广泛的适用范围。本研究旨在研制短短芽胞杆菌011可湿性粉剂，确定其制剂成分，为开发高效低毒活体微生物杀菌制剂提供基础，符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治（IPM）的要求。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试菌种

内生短短芽胞杆菌011菌株由湖南省食品科学与生物技术重点实验室分离、鉴定与保存。供试辣椒疫病菌由湖南农业大学植物病理实验室提供。

1.1.2培养基

BPY液体培养基、PDA固体培养基。

1.1.3供试试剂

载体：膨润土、滑石粉、高岭土、硅藻土、白炭黑。

助剂：十二烷基苯磺酸钠（DBS）、聚乙二醇（PEG8000）、吐温60、木质素磺酸钠、木质素磺酸钙、羧甲基纤维素钠。

保护剂：抗坏血酸、糊精、十二烷基苯磺酸钠。

稳定剂：碳酸钙、磷酸氢二钾、羧甲基纤维素钠。

1.2方法

1.2.1内生短短芽胞杆菌011发酵制备

种子液制备：用接种环挑取斜面保存的011菌株，接入BPY液体培养基中，装液量100 mL/250 mL，初始pH6.8， 30 ℃， 摇床180 r/min振荡培养24 h。

发酵培养：将以1%接种量接入装液量100 mL/250 mL发酵培养液中，30 ℃振荡培养60 h，摇床转速为180 r/min。芽胞含量≥4.0×1011，芽胞率≥90%。

1.2.2检测方法

采用平板菌落计数法，测定制剂的芽胞含量。

按照《中华人民共和国国家标准》对内生菌短短芽胞杆菌011可湿性粉剂进行测定。 润湿时间测定参照GB/T 54512001，悬浮率测定参照GB/T 148252006，细度测定参照GB/T 161501995， pH测定参照GB/T 16011993，加速贮存试验按GB/T 191362003。

1.2.3制剂加工工艺

将内生短短芽胞杆菌011摇瓶发酵液与载体按一定比例混合制成母液，鼓风干燥60 ℃烘干，研磨制成母粉。在母粉中添加一定比例的分散剂、湿润剂、稳定剂等，经喷雾干燥进风温度175 ℃，出风温度60 ℃制成可湿性粉剂。

1.2.4初始制剂成分配比

发酵液70%，载体10%，助剂10%，稳定剂2%，保护剂0.1%，白炭黑补足至100%。

1.2.5载体的筛选

菌株发酵为液态，选择膨润土、滑石粉、高岭土、硅藻土、白炭黑不同材料做载体，检测均匀母粉的湿润性、重量悬浮率，用平板菌落计数法测定各制剂的芽胞含量，比较各载体制剂松散性、成本等方面因素 选择最优载体。

1.2.6助剂筛选及复配助剂配比确定

在所制成的母粉中，分别添加10%的助剂，喷雾干燥加工成制剂，测定各制剂的润湿时间，时间越短其润湿性越好；比较各制剂悬浮率的差异，悬浮率越高，分散性越好；测定芽胞含量，根据结果筛选出最佳润湿剂、分散剂。

从助剂中筛选出悬浮性较高，润湿性较好的助剂。按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的质量比经粉碎机混合均匀 喷雾干燥制成可湿性粉剂，测定其悬浮率、润湿时间，选择出复配助剂的最佳质量配比。

1.2.7稳定剂的筛选

将筛选出的填料、发酵液、湿润剂及分散剂分别与待选稳定剂混合均匀后喷雾干燥加工成可湿性粉剂，以不加稳定剂的为对照。加速贮藏稳定性：进行热贮（54±2）℃ 14 d后测定芽胞存活率。每个处理重复3次。

1.2.8保护剂的筛选

将筛选出的填料、发酵液、湿润剂及分散剂分别与待选保护剂加工成可湿性粉剂，以不加保护剂为对照，稀释后涂布在平板上 每个处理重复3次 在距离254 nm紫外灯（20 W）40 cm处照射12、24 h后 计算芽胞存活率。

1.2.9制剂稳定性测定

取100 g内生短短芽胞杆菌011可湿性粉剂置于℃和室温条件下贮存，每10 d测定样品的芽胞含量，测定11次，确定制剂贮存期间芽胞含量的变化。

2结果与分析

2.1载体的筛选

载体在可湿性粉剂中占较大比例 因此载体的润湿性和悬浮率对制剂的润湿性和悬浮率影响大。由表1可知：各制剂的润湿时间均达到国家标准。各载体亲水性较强且表面积大 导致吸水性强。其中滑石粉制剂的湿润时间为10 s。不同材质的载体颗粒不同，故悬浮率有差异。膨润土、硅藻土制剂悬浮率分别为60%、68%，均低于标准，高岭土、滑石粉、白炭黑所制成的制剂悬浮率≥70%，具有较好的悬浮率，适用于本研究制剂的开发。将制备的各制剂于室温（25 ℃）贮藏14 d后测定活芽胞含量。综合考虑各制剂悬浮率、润湿时间、价格等因素，筛选出最适载体。其中滑石粉制剂，芽胞含量贮存后有2.16×109 cfu/g，高于其他载体制剂。

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